马萨诸塞大学研究：模型土壤组成与高压灭菌循环对土壤含水率的影响

马萨诸塞大学研究：模型土壤组成与高压灭菌循环对土壤含水率的影响

通讯作者: Luiz A.-Horta, M.

通讯作者单位: 马萨诸塞大学

实验设计

本研究中使用的模型土壤由 70% 酸洗沙、20% 酸洗膨润土和 10% 氯化钙处理膨润土组成。混合均匀后，测量土壤含水量。对模型土壤进行三个循环的高压灭菌，每个循环之间至少间隔 48 小时，以增加杀死​​新发芽孢子的机会。每20 g人工土壤微环境中添加0.22 μM过滤混合落叶DOC（0.1 mgC g土-1）和0.023 ml sg土-1（含有5 μm过滤酵母提取物的改良2×VL55基础培养基）。通过在添加垫料DOC后15天测量土壤呼吸，根据未检测到呼吸的结果，确保接种前微环境的无菌性。

我们从温带落叶森林土壤（美国马萨诸塞州，42°30′30″N，72°12′28″W）中提取了微生物群落。通过提取和浓缩，我们将浓缩物定义为D0接种物，并将其作为液体土壤接种剂进行接种。然后将D0菌液分别连续稀释至1000倍和100,000倍，定义为D1和D2处理。为了排除真菌和大细菌细胞，我们提取了 D0 提取物，将其通过 0.8 μm 膜，并将过滤后的接种物定义为 Bonly 处理过的。

在培养的前 90 天每周添加底物时，调整水含量以考虑水蒸发。纤维二糖和硝酸铵溶液分别用作底物中的碳源和氮源。为了最大限度地提高养分利用率，培养的最后 30 天不添加底物。此外，在培养第91天重新混合土壤微环境，以确保微环境中基质利用的均匀性。通过测量二氧化碳通量，第一个月每周监测一次微生物群落的生长，此后每两周监测一次。

培养120天后，在无菌条件下收集土壤微环境。每个微环境样品均过2 mm筛，随后用于酶分析、水分含量测定、微生物量碳（MBC）测定以及DNA提取用于生理生化指标测定。除此之外，我们还对一些样品进行了短期孵化（在两个温度（15°C 和 25°C）下进行低湿度和 D0 多样性处理），以评估非生物条件（温度和湿度）的变化 CUE 如何受到独立影响的社区转移。

结果

1. 模型土壤中微生物群落的组合

模型土壤中存活有代表性的4个细菌门和3个真菌门，其中包含1036个细菌操作分类单元（OTU）（100％一致性）和270个真菌OTU（97％相似性）。实验操作成功地改变了微生物多样性，与所有其他接种物相比，来自最低稀释度接种物 (D0) 的群落中的细菌和真菌丰富度更高（图 1）。然而，与其他研究类似，多样性的下降与稀释程度不成正比：在稀释 3 个数量级 (D1) 和 5 个数量级 (D2) 的情况下，微生物多样性的下降相似，并且对于细菌来说，据说是 77.4% (CI95%=[63.4-90.6%])，对于真菌来说是 80.9% (CI95%= [71.6-106.2%])分别为 57.9% (CI95%= [45.4-70.5%]) 和 43.9% (CI95%= [19.5-68.3%])。基于大多数样品中真核细胞丰度为 0 的事实，我们得出结论，0.8 μm 过滤的 D0 接种物能够成功去除真核细胞（“Bonly”）（图 1）。然而，由于初始土壤中的一些孢子对灭菌具有抗性，因此真菌序列仍然存在于一些 Bonly 样品中，但在未接种的对照处理中没有生长。最后，通过将与D0接种量相同的土壤暴露于干热（120℃，30分钟）和苯酚（1.5％，1小时）环境中，成功富集了孢子-（SF）中的群落。

图 1 调节微生物多样性的实验设计。 a代表通过不同方法对温带落叶森林土壤接种样品中微生物多样性的调控； b 代表两种湿度（30% 和 60% 田间持水量）和两种温度（15°C 和 25°C）。将接种物加入人工土壤中，培养120天； c表示培养结束时模型土壤的图像； d 代表不同处理下细菌（灰色）和真菌（白色）的平均丰富度。

基于细菌和真菌管家基因的实时定量 PCR (qPCR)，我们评估了 120 天培养结束时土壤样品中真菌和细菌的丰度。通过研究发现，不同处理之间细菌和真菌基因拷贝数没有统计学差异，但在Bonly处理中，细菌细胞数量显着高于所有其他处理，而真菌数量显着高于所有其他处理。显着低于所有其他处理。

我们能够在模型土壤中形成多样性和群落结构显着差异的群落。丰富度主要由多样性控制驱动，而群落结构则受土壤湿度和温度调节的影响（表1）。模型土壤中的微生物丰富度低于天然土壤，但高于之前用于评估多样性与生态系统过程之间关系的土壤样本。尽管在解释天然土壤的结果时需要仔细考虑，但基于模拟土壤的矩阵，我们可以了解生物和非生物因素如何相互作用以驱动空间结构土壤环境中微生物土壤碳利用效率（CUE）。 ）进行研究。

表 1 由多样性 (Div)、湿度 (Mois) 和温度 (Temp) 处理解释的方差百分比，以及它们对细菌和真菌 α 多样性以及细菌和真菌群落结构的相互作用影响。

2 多样性和 CUE 之间的经验联系。

我们使用不依赖底物的 18O-H2O 方法来确定过去 4 个月在相同温度和湿度条件下培养样品的群落的 CUE。 CUE 在其他研究中测量的值范围内变化。我们假设 CUE 与多样性正相关。总体而言，我们观察到，与第一次 (D1) 和第二次稀释 (D2) 的群落相比，最多样化的 D0 处理具有更高的群落 CUE，而与所有其他处理相比，Bonly 的群落具有更高的 CUE。社区 CUE 较低。

CUE 代表碳在生长和呼吸中的分配，为了了解多样性如何影响它，我们分别评估了生长和呼吸反应。我们没有观察到真菌多样性和 CUE 之间存在显着相关性。但对于细菌来说，在高湿度条件下，生长速率随着系统发育多样性（PD）的增加而增加（图2a），而不是呼吸作用（图2b），这导致在潮湿而不是干燥土壤中生长速率增加。细菌系统发育多样性与CUE之间存在显着的正相关（图2c）。有趣的是，细菌多样性高（50-80%）的土壤通常保持较高的 CUE 水平。这由断点证实，其中阈值出现在 PD 值 4.48 处，此后仅观察到更高的 CUE 值（t=4.51，df=86，R2=0.28，P）。相反，多样性较低的样本显示出完整的CUE范围，这表明群落组成和环境因素等其他因素在决定群落CUE方面发挥着重要作用。尽管我们的研究报告了多样性和 CUE 之间的正相关关系，但其他研究评估了呼吸和多样性之间的关系，发现这种关系可能是正相关，也可能是负相关。很少有研究评估多样性与增长率或 CUE 之间的关系。之前的一项研究基于磷脂脂肪酸（PLFA）分析来考察微生物群落组成与 CUE 之间的关系，发现虽然 PLFA 在测量群落组成方面的分辨率远低于测序，但两者之间没有相关性。出相关关系。不同研究中多样性与碳循环功能响应的差异可能是由于不同实验中多样性水平不同所致，最近的综述得出结论：只有在低多样性群落（物种）中，多样性与碳循环功能之间存在正相关关系是一致的。然而，只有在 PD 值为 4.48 后，我们才观察到多样性和 CUE 之间没有显着关系。这表明需要适度的多样性水平来确保我们简化的模拟土壤系统中的高 CUE 水平。尽管在天然土壤中观察到的多样性水平高于我们的简化系统，但天然土壤也更加复杂。例如，生活在天然土壤中的微生物经历许多不同的底物，而在我们的简化系统中，我们使用单一底物（纤维二糖）。这表明，在多样性与 CUE 之间的关系饱和之前，天然土壤可能需要更高水平的多样性。总的来说，这些结果表明，通过评估模拟土壤系统中的多样性与功能关系，与液体培养等不太复杂的环境相比，需要更高水平的多样性来饱和这种关系。此外，由于我们使用的是固体基质系统，我们能够评估生物和非生物条件之间的相互作用如何塑造碳循环的这一组成部分。

图 2 细菌多样性与生长、呼吸和线索之间的关系。 ac 分别代表细菌系统发育多样性 (PD) 与生长 (a)、呼吸 (b) 和提示 (c) 之间的关系。

互补效应可以解释为什么我们在潮湿而非干燥条件下观察到多样性与 CUE 之间的这种正相关关系。现有研究表明，互补效应对功能的影响因不同的非生物条件而异。在这项研究中，我们使用水相作为微生物相互作用中心，以允许在高湿度处理中发生物种相互作用和互补效应。杂交可以作为解释物种之间这种互补相互作用的机制之一。例如，如果一些微生物从糖异生底物产生氨基酸，而其他微生物从糖酵解底物产生氨基酸，则这可能具有生长促进作用。在这个例子中，微生物可以在高湿度下获取其他微生物产生的氨基酸，从而实现更有效的群落生长。此外，由于CUE是生长和呼吸的总和，只有当多样性对生长的影响大于其对呼吸的影响时，CUE才会受到多样性的正向影响（图2）。非生物因素的变化也可能通过改变资源吸收率或需求来改变物种相互作用的类型。在低含水量培养的微环境中，我们发现土壤团聚体与生长、呼吸和CUE之间呈正相关。这可能表明，在低湿度条件下，微生物群落的生长更多地受到总体水平上的资源的限制，因此与总体尺寸相关。相比之下，在潮湿的土壤中，我们没有发现土壤团聚体与生长、呼吸或 CUE 之间的关系，这表明这些土壤中的微生物在团聚水平上并不局限于资源。因此，低含水量可能会限制种间互补相互作用的程度，这恰好解释了为什么这些土壤中的多样性和 CUE 之间不存在正相关关系。另外，另一种可能的机制是干燥应力导致的额外成本，这可能会削弱高水分样品中发现的正相关关系。因此，微生物多样性对 CUE 的影响取决于非生物条件。

3 温度和湿度对CUE的影响

土壤中的温度和含水量驱动土壤中的 CUE。与之前的研究结果一致，我们在较高温度下培养的微环境中测量到较低的 CUE（t=10.75，df=172，P）。在较高温度下培养的群落CUE的降低与rrN拷贝数的增加相关，其中rrN拷贝数高与低生长效率相关，但并不总是观察到这种现象。水分处理对 CUE (t=-1.81, df=161, P=0.070) 和 rrN 无显着影响。鉴于微生物群落在长期温度和湿度条件下存在差异（表1），我们同时进行了额外的培养，以评估对短期温度和湿度变化的直接生理反应。

我们测量了微环境子集中所有不同非生物组合下的 CUE（图 3a）。虽然已知长期非生物条件会改变微生物群落结构，但这些条件的短期变化应该会引起独立于群落变化的生理变化。我们假设 CUE 将随着温度的升高而降低。然而，短期温度升高 10°C 显着增加了质量特异性呼吸（图 3b）和生长（图 3c）（分别为 188% 和 176%），但没有导致显着的 CUE 响应（图3d）（t=0.36，df=51，ns）。研究表明，在变暖期间需要更大的物种丰富度来满足微生物的生长。我们的 D0 处理具有最大的微生物多样性，这些结果表明，其群落能够在温度升高 10°C 的情况下生存，而不影响 CUE，而不改变呼吸：生长关系。

湿度的短期变化对 CUE 的影响比温度的影响更大。当WHC从30%增加到60%时，呼吸和生长分别增加146%和169%。与润湿后的土壤呼吸相比，生长的增加导致 CUE 绝对增加 8%（图 3d）。我们假设，更高的生长可能是由于添加水时更高的养分利用率。湿度是 CUE 的强大驱动因素的另一个可能的解释是，与高湿度相比，微生物群落在低湿度时经历了不同的水势。之前的一项研究表明，CUE 随着长期干旱而降低，这可能与干燥或细胞内溶质或 EPS 的产生导致的额外损耗有关，但本研究中基于 DNA 的生长测量均无法对这两个因素进行评估。

图 3 温度和湿度的短期变化对呼吸、生长和 CUE 的影响。 a代表在两个温度（15和25°C）和30%持水能力（WHC）下生长D0处理的所有组合； bd 代表湿度和温度变化对呼吸商 (b)、生长 (c) 和 CUE 效果 (c) 的影响。

4 CUE 作为生物和非生物驱动因素之间相互作用的函数

与天然土壤相比，模型土壤系统提供了一个独特的平台来控制在土壤过程中发挥重要作用的特定生物和非生物成分，并将它们与其他混杂变量隔离开来。因此，它们可用于增进对主要微生物生态问题的了解。我们使用结构方程模型（SEM）来确定生物成分（真菌和细菌多样性、群落结构、真菌与细菌比率、潜在的细胞外酶活性和微生物起源的土壤聚集）影响CUE的程度（图4）。基于非生物驱动因素（湿度和温度）可以直接驱动CUE，也可以通过影响CUE的生物驱动因素间接驱动CUE的假设，我们构建了模型路径结构。基于 SEM，我们测试了以下假设：

（1）不同的社区结构会导致不同的社区CUE；

(2)细菌多样性对CUE的影响呈正相关；

(3)胞外酶库代表微生物生长效率的消耗，因此对CUE产生负面影响；

(4) 真菌的存在也会增加 CUE

(5) 微生物驱动的土壤团聚作为细胞底物供应的替代品对 CUE 具有积极影响。

总体而言，我们的模型解释了 CUE 30% 的变异性（图 4）。

尽管温度通常被认为是 CUE 的控制变量，但我们的结构方程模型表明，温度和湿度仅间接影响 CUE，并不通过生物成分发挥作用（图 4）。细菌群落结构和多样性是 CUE 的最强驱动因素。细菌多样性对 CUE 有积极影响。然而，由于群落结构由非度量多维标度（NMDS）的第一轴表示，其具有任意方向，因此我们无法给出细菌群落结构与CUE之间的准确路径系数。 CUE 的其他直接驱动因素是真菌、细胞外酶活性和土壤团聚体的存在。潜在胞外酶活性/MBC与CUE之间存在负相关关系，这支持了以往研究提出的观点，即酶作为微生物生长的消耗，会影响微生物的生长。我们发现，与之前的研究不同，真菌与细菌的比例不会影响 CUE。这种差异可能是由于与天然土壤相比，我们的人造土壤中真菌与细菌的比例较低。尽管如此，我们在真菌生长的微观世界中观察到更高的 CUE（模型的“真菌存在”部分）。与此一致的是，Bonly 治疗显示出最低的 CUE 值。然而，真菌丰富度和群落结构并不是 CUE 的驱动因素，并且由于细菌比真菌生长得更快，我们假设 24 小时孵育期间的 CUE 测量主要捕获了细菌的生长。真菌的存在对 CUE 的积极影响表明，一些通用真菌功能对于群落生长效率非常重要（图 4）。例如，真菌可以为细菌提供有机氮源，因为我们在 Bonly 微环境中检测到很少或没有 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶 (NAG) 活性。因此，微生物群落对CUE的影响可以通过多种机制发挥。

图4 结构方程模型显示了土壤非生物和生物因素对CUE的相对影响。

CUE是呼吸和生长的综合变量，取决于微生物的生理和环境条件。需要强调的是，CUE 的很大一部分变化在模型中仍然无法解释，这意味着其他因素也很重要，此处未捕获。总之，这些结果强调了非生物环境（例如温度和湿度）的变化如何与群落组成和多样性丧失相互作用，从而影响群落 CUE。

综上所述

面对气候变化，我们必须了解全球环境变化将如何影响土壤碳循环。据我们所知，这项研究首次探讨了生物和非生物成分如何相互作用，通过操纵微生物群落来驱动土壤系统中的 CUE。我们的结果强调，微生物群落的变化可以改变 CUE，并且微生物多样性对 CUE 的积极影响可以在干燥条件下被抵消。

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